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懸浮細(xì)胞如何固定做免疫熒光?

更新時(shí)間:2023-11-29   點(diǎn)擊次數(shù):2325次

懸浮細(xì)胞總是在孵抗體和洗的時(shí)候被沖掉,懸浮細(xì)胞做免疫熒光怎么固定?


傳統(tǒng)方法

實(shí)驗(yàn)步驟:

1. 細(xì)胞在冰浴中冷卻,然后用臺(tái)式離心機(jī)于4℃以800 g 離心5 min,吸去培養(yǎng)液并以4℃PBS重懸細(xì)胞。

2. 離心吸去PBS,以1~2 ml 2%PFA固定液,或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重懸細(xì)胞,置冰上固定30 min。

3. 離心、吸去固定液,用15 ml 4℃ PBS重懸細(xì)胞,放5 min 后,用PBS再次洗滌細(xì)胞。

4. 稀釋的第一抗體于4℃用微量離心機(jī)以13 500 g 離心2 min,250 μl 抗體足夠用于5x106細(xì)胞。

5. 離心細(xì)胞,吸去PBS,重懸細(xì)胞于第一抗體中,置4℃溫育1 h。

6. 用4℃ PBS稀釋細(xì)胞和抗體至15 ml。

7. 離心,吸去PBS,以4℃ PBS重懸細(xì)胞,重復(fù)1次。

8. 第二抗體4℃用微量離心機(jī)以13 500 g 離心2 min,5x106細(xì)胞用250 ul 抗體足夠。

9. 吸去PBS,以第二抗體重懸細(xì)胞,4℃溫育1 h,重復(fù)步驟6及步驟7。

10. 除非立即觀察細(xì)胞,否則在進(jìn)行細(xì)胞濃縮的下一步操作之前應(yīng)以鋁萡包裹離心管并冷藏。

11. 離心細(xì)胞并以少量PBS重懸(勿用水),將細(xì)胞懸液滴于多聚-L-賴(lài)氨酸覆層的載玻片上,加上蓋玻片,盡可能馬上觀察結(jié)果。 

鏡下觀察:沒(méi)有細(xì)胞,原來(lái)掉片了!!!

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